KRİTİK NOKTADA KURUTMA METODU

Faz diagramı katı, sıvı ve buharın bulunduğu sıcaklıklara karşılık basınçları göstermektedir. Fazlar arasındaki sınırların faz

diagramı üzerinde birleştiği nokta, üçlü nokta olarak adlandırılır. Sıvı ve buhar fazlar arasındaki sınır boyunca sıvı ve buharın

 birlikte bulunabileceği ve böylece aynı yoğunluğa sahip oldukları belirli bir sıcaklık ve karşılık gelen basıncı seçmek mümkündür.

 Bu kritik sıcaklık ve basınçtır.

Kritik noktada kurutma bu fizik prensibine dayanır. Biyolojik dokudaki su realisable basınç için kritik sıcaklığı, çevreninkinden

biraz fazla olan uygun bir inert sıvı ile yer değiştirilir. Sıvıların seçimi oldukça sınırlıdır ve daha önceleri Freon 13 ve Nitrik Oksit

ile çalışmasına rağmen, bugün CO2 yayğın olarak kullanılmaktadır.  CO2 'le , yaklaşık 35 C 'de ki kritik noktaya, yaklaşık

1200 PSI basınçta ulaşılabilir. Bu nedenle, eğer su ile sıvı CO2 yer değiştirirse ve sıcaklık, kritik sıcaklığın üzerine çıkarsa,

sıvı CO2  yoğunluğu değişmeden  ve dolayısıyla morfolojiyi ve ultra-yapıyı bozan yuzey gerilim etkileri olmaksızın buhara

dönüşür. Sıvı CO2, su ile yeterince karışabilir olmadığından, hem su hem de sıvı CO2 ile karışabilir olan bir ara sıvının

kullanılması gereklidir. Pratikte, yaygın olarak kullanılan ara sıvılar; metanol, etanol, amly asetat ve asetondur.          

Doku Hazırlama

(a) Yıkama

(b) Fixation

(c) Dehydration

(d) Sıvı CO2 ile yer değiştirmek

(e) CO2 ile yer değiştirmek

(f) Süper-Kritik sıcaklığa ısıtmak

(h) Basıncı serbest bırakmak

Not: Eğer Dehydration aseton ile yapılmış ise basamak (d) atlanır. Çünkü aseton CO2 ile karışabilir.

Proses Akış Şeması Aşağıdadır.

  Yıkama

Numuneler mukus, kan, serum veya diğer yüzey üzerinde yapışabilen bulaşıklardan temizlenmelidir. Yıkama aracı fizyolojik

olmalı ve dokunun yapısında veya biçiminde bir değişmeye sebep olmamalıdır.

  Fixation

Eğer numune önce Osmium tetraoksit içinde fikse edilmişse, izotonik olmalıdır. Bu daha sonra asıl Fiksatif olan

glutaraldehyde ile takip edilebilir. Eğer glutaraldehyde tek fiksatif olarak kullanılıyorsa, fiksasyon saatlerden ziyade günlerce

sürmelidir. Aldehit fiksasyonunun kısa periyodları yeterli değildir, dokuları osmotik değişikliklere karşı dayanıklı yapmazlar.

Bir saat için1% lik glutaraldehyde ile başlamak ve 3% ile devam etmek daha iyi sonuçlar verir.

  Dehydration

Numuneler basınç odacığına transfer edilirken havada kuruma riskini azaltmak için numunelerin mümkün olduğunca holder'lar

içinde veya isteğe bağlı olarak porlu sepetler içinde tutulmaları tavsiye edilir.

Dokuyu fikse ettikten ve tampon tuzları ve diğer elektrolitlerden uzaklaştırmak için distile su ile yıkadıktan sonra, dokunun

kendi su içeriği CO2 veya freon 13 ile karışabilir bir sıvı ile yer değiştirmelidir. 

Yaygın kullanımda olan metodlar;

(a) Su -Aseton - CO2

(b) Su - Aseton - Freon 13

(c) Su - Etanol - Amyl Asetat - CO2

(d) Su - Etanol - Freon 113 - Freon 13 

Literatürde hangi metodun, eğer varsa, en iyi sonucu verdiği henüz açık değildir. Hepsinin benzer kalite sonuç vermesi de

mümkündür. En uygun metod (a) metodudur; çünkü en kısa zaman alan ve en ucuz geçiş sıvısını kullanan metoddur.

 (c) metodu ise en tercih edilendir, kuruma dönemi başlamadan önce ara sıvının uzaklaşıp uzaklaşmadığının iyi bir göstergesi

 olan amly asetatın güçlü kokusu nedeniyle.

Dehidratasyon asetonla yapılacaksa, takip eden "Difüzyon Dehidratasyon" metodu kullanılır:

(a) Dokuyu 20% asetona koyun. (5 ml)

(b) Desikatöre yerleştirin.

(c) Desikatörü, biraz susuz kalsiyum sülfat içeren 100% asetonla doldurun.

(d) Desikatöre susuz CaCl2 de yerleştirin.

(e) Aseton kaynayıncaya kadar desikatörü su ile pompalayın.

(f) Vakum altında kapatın ve bir gece bırakın. Desikatör açıldığı zaman, dokunun 100% distile aseton içinde tamamen

dehidrate olduğu bulunacaktır. Eğer dehidratasyon etanol ile yapılırsa, takip eden metodun 1 mm kalınlıktaki doku parçaları

ile yapılması tavsiye edilir:

(i) 30% etanol içinde 15 dakika tutun.

(ii) 50% etanol içinde 15 dakika tutun.

(iii) Bunu 70%, 80%, 90%, 95% ve 100% lük içinde 15 dakika olacak şekilde tekrarlayın.

Not: Bu metodla daha dikkatli olunduğunda, daha iyi sonuçlar alınır. Hızlı dehidratasyon dokunun büzülmesine sebep

 olur. Dokunun daha geniş parçaları orantılı olarak uzun zaman peryodlarına ihtiyaç gösterir.

  Yer Değiştirme

Etanolla dehidratasyondan sonra dokuyu basınç çemberine koymadan önce amly asetat veya Freon 113 ile değiştirme

 yapmak gereklidir. İki sıvının değişiminin direkt olarak değil de aşamalı bir şekilde (25:75, 50:50 vb.) yapılması tavsiye edilir.

 Her adımda 15 dakika kafidir.